尊龙凯时细胞培养指南

一、细胞培养条件

细胞名称：生长特性：贴壁生长，冻存条件：无血清冻存液。

培养体系：基础培养基由1:1的MCDB105（最终浓度15g/L碳酸氢钠）与M199（最终浓度22g/L碳酸氢钠）混合而成，同时添加15%的优质胎牛血清及1%的双抗。

传代方法：首次建议使用1:2的传代比。传代情况：每2天更换培养基。

备注：请使用无菌离心管收集培养基，作为对比培养。若效果不理想，建议直接购买尊龙凯时的完全培养基。

二、细胞收到后的处理

细胞在良好状态下应灌满完全培养液并封口，这是运输细胞的最佳方法。收到细胞后，请使用75%酒精喷洒细胞瓶表面进行消毒，然后在超净台内严格执行无菌操作。将细胞瓶放入37℃、5%CO2培养箱中静置3-4小时，以帮助细胞稳定状态，然后再进行其他处理。显微镜下观察细胞生长情况，并拍摄不同倍数的照片保存（建议40x、100x和200x各一张），前三天的照片是重要的售后依据，未提供照片视为状态良好。

在传代后，建议一瓶使用原瓶的完全培养基，另一瓶使用自配完全培养基，以便进行对比培养，并在换液后将瓶盖稍微拧松。

三、细胞培养步骤

a. 细胞传代：若细胞汇合度未超过80%，请将完全培养液收集至离心管中，并保留5ml完全培养基放入37℃、5%CO2培养箱中培养；若细胞密度超80%，可进行传代，具体步骤如下：

1. 弃去培养上清，用无钙镁PBS润洗细胞1-2次。
2. 向培养瓶中添加0.25%胰蛋白酶消化液约1-2ml，放于37℃培养箱中消化1-2分钟，显微镜下观察细胞消化情况。若细胞开始变圆并部分脱落，则迅速将其取回操作台，轻轻敲击培养瓶，再添加5ml完全培养基以终止消化。
3. 轻轻吹打细胞使其完全脱落后吸出悬液并转移至离心管中，1000RPM离心5分钟。弃去上清，加入1-2ml完全培养基重新悬浮细胞。
4. 将细胞悬液按1:2的比例分瓶（分至两个T25瓶），并在每瓶中补充5-8ml新的完全培养基，然后再次放入37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。

b. 细胞冻存：

1. 当细胞生长至覆盖培养瓶80%面积时，弃去培养液，并用PBS清洗细胞一次。
2. 向培养瓶中添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml，轻轻观察，待细胞回缩变圆后加入5ml完全培养液以终止消化，再轻轻吹打使细胞脱落，将悬液转移至15ml离心管中，1000rpm离心5分钟。
3. 弃去上清，沉淀细胞后加入1ml尊龙凯时无血清冻存液，混匀后转入冻存管中。
4. 将冻存细胞直接放入-80℃冰箱冷冻。若后期需转入液氮罐，需在-80℃冰箱中存放24小时以上。

细胞复苏：将冻存管从液氮中取出（佩戴防护装备），快速放入37℃水浴中解冻，直至管内无结晶。随后用75%酒精擦拭冻存管外壁，并将内容物移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000rpm离心5分钟。弃去上清，加入5ml完全培养基重悬，接种至T25培养瓶，放入37℃、5%CO2细胞培养箱中继续培养；次日更换为新鲜完全培养基。

注意事项：某些细胞可能会在运输过程中因贴壁不牢而脱落，这是正常现象。如脱落较多，请收集所有培养液至离心管中，并将上清液用于过渡培养、沉淀后加入胰酶继续处理。

五、售后条款

1）细胞出现问题的重发情况及判定标准：

1. 细胞在运输中遭遇问题（丢失、瓶身破损、严重漏液等），可重发。
2. 细胞污染问题，请在收到产品48小时内提供真实实验结果，经核实后可重发。
3. 常温发货细胞静置24小时后或干冰发货细胞复苏后的24小时内的细胞存活率低（需提供清晰的细胞状态照片），可重发。
4. 干冰冻存发货的细胞复苏后24小时或常温发货的细胞静置4小时后未开封出现污染，可重发。
5. 细胞活性问题需在7天内提供真实实验结果，使用台盼蓝染色法判定活力，经过核实后可重发。
6. 细胞收到当天及第2、3天需拍照，若3天内未告知，视为产品合格。4-7天内若出现问题，需提供前三天照片及操作步骤，技术人员会判定责任并决定是否重发。

2）细胞出现问题不予重发的情况：

1. 因客户造成的细胞污染，不予重发。
2. 因客户不正确操作导致细胞状态不佳，不予重发。
3. 非推荐细胞培养体系致使的细胞问题，不予重发。
4. 未提供前三天照片的细胞状态不佳，不予重发。
5. 培养中经其他处理的细胞，不予重发。
6. 若在收到两天内未告知的问题，不予重发。
7. 具体情况将根据实际情况而定。